Pubblicazione N°6

RISULTATI PRELIMINARI SUGLI EFFETTI DELLA RADIAZIONE UV ATMOSFERICA SULLA DINAMICA DI SVILUPPO DI COORTI DI XENOPUS LAEVIS NELLO STADIO LARVALE

Pubblicato per gli atti dell'XI° Congresso Nazionale della Società Italiana di Ecologia
Parco Nazionale del Circeo - Sabaudia 12-14 settembre 2001

Esistono ormai dati certi sull'incremento della radiazione ultravioletta al suolo dovuto principalmente alla diminuzione della concentrazione d'ozono stratosferico, anche alle medie latitudini. Molte ricerche sono state condotte sull'interazione fra gli organismi viventi e la parte di ultravioletto atmosferico relativa alla banda spettrale 280-320 nm.
Quando le dosi di radiazione sono tali da non determinare mortalità, effetti sub-letali (diminuzione di biomassa, riduzione della mobilità, ritardo di sviluppo) sono comunque misurabili negli organismi viventi oggetto di studio.
L'intento di questo lavoro è di mettere in evidenza gli effetti sub-letali a scala macroscopica della radiazione UV atmosferica su coorti di Xenopus laevis in sviluppo nello stadio larvale.
Sono state utilizzate tre coorti: una coorte ha svolto la funzione di controllo e per l'intera durata dello stadio larvale è stata allevata in laboratorio in condizioni controllate (temperatura costante 24.0 ± 0.3 °C; assenza di radiazione solare). Medesima procedura è stata seguita per le altre due coorti, con l'unica differenza di un'esposizione a radiazione solare con cadenza giornaliera, per tutta la durata dello stadio larvale. I tempi di esposizione alla radiazione sono stati differenti e tali da produrre, in un caso, dose media giornaliera di irradianza UV di 334 Jm-2d-1 , mentre nell'altro caso la dose media giornaliera è stata di 1290 Jm-2d-1.
Un primo effetto delle diverse dosi di radiazione agenti sulle coorti è stato di determinare differenti percentuali di mortalità.
Un'analisi più accurata sulla dinamica di sviluppo negli stadi larvali ha permesso di evidenziare variazioni delle velocità di raggiungimento dello stadio di maturazione delle coorti esposte rispetto al controllo.
Il metodo d'indagine è, a nostro avviso, tale da suggerire il ruolo di indicatore biologico della specie considerata. La sensibilità a lievi variazioni dell'ambiente fisico nel quale si trova a svilupparsi potrebbe rivelare nuovi aspetti sull'interazione tra cambiamenti climatici ed equilibrio degli ecosistemi.

Parole chiave: UV, dinamica di sviluppo, effetti sub-letali., indicatore biologico.
1- INTRODUZIONE

Esistono molteplici evidenze sperimentali riguardo gli effetti della radiazione ultravioletta (UV) su organismi viventi.
Gli effetti hanno inizio quando una molecola di importanza biologica assorbe energia (fotoni) dalla radiazione UV. Le molecole biologiche più interessate sono gli acidi nucleici e in misura minore le proteine (Harm, 1980). L'assorbimento, nella molecola di DNA, avviene da parte delle basi azotate con formazione di fotoprodotti (dimeri pirimidinici e fotoprodotti 6-4) (Errera 1952). Queste alterazioni del filamento necessitano di tempo per essere riparate (Freifelder 1987, Buma et al. 1997), e nel caso che il loro numero risultasse molto elevato si potrebbe verificare la mancata replicazione del filamento (Mitchell and Karentz, 1993).
E' stato provato che la radiazione UV è in grado di ridurre il tasso di metabolismo e la capacità riproduttiva di cellule, batteri e virus (Kumar et al. 1996, Sinha and Hader 1997, Rajagopal et al. 1996).
Una serie di lavori vertono sugli effetti della radiazione UV su specie viventi acquatiche. Gli studi sono iniziati più di 75 anni fa (Huntsman, 1925) e confermati nel corso degli anni e recentemente (UNEP, 1998)
E' stato riscontrato che l'aumento, a livello del mare, della radiazione UV atmosferica (nella banda UV-B 280-320nm) determina una maggiore concentrazione del fitoplankton verso maggiori profondità: la stretta relazione fra questo organismo e la quantità di radiazione visibile fa si che a profondità più elevate la produttività risulti notevolmente ridotta (Smith, 1989). In più, l'esposizione ad UV-B ne compromette la motilità (Worrest, 1986; Hader, 1993a,b), induce cambiamenti nella struttura del DNA (Karentz, 1991, Buma et al. 1995, 1997), causa decolorazione dei pigmenti fotosintetici (Ekelung and Hader, 1988) e riduce la capacità di orientamento rispetto alla luce e alla gravità (Hader and Hader 1988, 1990).
Sullo zooplancton l'esposizione ad UV-B produce danni irreversibili tali da portare alla morte l'organismo (Peak et al. 1982), riduzione della fecondità (Damkaer 1982), riduzione della capacità di riparare i danni (Smith 1989), inibizione della crescita e diminuzione della biomassa (Siebeck et al. 1994a,b, 1999, Zagarese et al. 1994, Hurtubise 1998).
Effetti sono stati osservati su piante esposte a radiazione UV-B atmosferica (Tevini and Taramura 1989, Saile-Mark and Tevini 1997), su specie anfibie (Blaustein et al. 1997a,b) e sull'uomo (Diffey and Oakley 1987, Gange 1986, Farr et al. 1988). Recentemente (Wiegleb Edstrom et al. 2001) ricerche sono state condotte sull'azione dell'UV-A e radiazione visibile sulla pelle umana riscontrando mutazioni delle sequenze di basi azotate del DNA.
Nel 1979 Hunter et al. hanno condotto un esperimento esponendo ad UV-B delle acciughe dei mari del nord negli stadi di uovo e di larva. Gli effetti che hanno osservato sono lesioni al cervello e agli occhi, dispersione dei pigmenti all'interno dei melanofori e, di grande interesse per noi, ritardo di crescita e ritardo dello sviluppo. In base all'ipotesi che un ritardo nella replicazione del filamento di DNA indotto da UV-B produca un effetto, non letale e potenzialmente misurabile, a scala macroscopica abbiamo realizzato un esperimento per osservare se la radiazione UV atmosferica produce un aumento dei tempi di maturazione di coorti di Xenopus laevis ad essa esposte, rispetto le coorti non esposte.

In base all'esperienza sulla dinamica di popolazione di piante e artropodi (Severini et al. 1990a,b; Severini et al. 1996) e su esperimenti di laboratorio, riguardo lo sviluppo a temperatura costante di anfibi e anostraci (Guglielminotti 1994, Carlini 2000) ed effetti di stress su una popolazione di anfibi (Dattilo 1999, Bracchini 1999), abbiamo condotto questo esperimento sulla modifica della dinamica di sviluppo di coorti di X. laevis esposti a radiazione UV atmosferica. Secondo noi gli effetti di uno stress tale da non produrre mortalità (stress blando), possono essere rivelati con maggiore chiarezza su coorti di individui piuttosto che sui singoli. In genere la dinamica di sviluppo di coorti a temperatura costante (24°C) e sotto le medesime condizioni (controllate) sperimentali ha un andamento caratteristico: ciò ha permesso di determinare, entro i limiti della variabilità genetica, distribuzioni dei tempi di maturazione sempre dello stesso tipo.
L'esperimento che ci siamo proposti di eseguire è stato di verificare in che modo la radiazione UV atmosferica fosse in grado di modificare la dinamica di sviluppo, e in particolare la distribuzione dei tempi di maturazione, di coorti di X. laevis nello stadio larvale. In tre differenti microcosmi (acquari) sono state allevate tre diverse coorti provenienti dalla stessa oviposizione. Due coorti sono state esposte, giorno per giorno, alla radiazione con tempi di esposizione (dosi) differenti. Un'altra coorte non è stata esposta a radiazione e ha quindi svolto la funzione di controllo. Ogni giorno tutti gli individui delle coorti sono stati osservati e catalogati in stadi di sviluppo secondo lo schema di Nieuwkoop & Faber (1956); ciò ha permesso di controllare, durante tutto l'esperimento, l'avanzamento delle coorti attraverso lo stadio larvale e di registrarne le "velocità" di sviluppo. L'analisi dell'indice di avanzamento attraverso gli stadi e della distribuzione dei tempi di maturazione ha permesso di evidenziare le modalità d'azione della radiazione UV atmosferica sulla dinamica di sviluppo delle coorti esposte rispetto il controllo.

2.1- Matrici Stadio Frequenza, indice d'avanzamento, distribuzione dei tempi di maturazione

Un vivente qualsiasi, nel corso della propria vita, passa attraverso una successione ordinata di stadi di sviluppo (Manly, 1974). La definizione di questi stadi è arbitraria; Tuttavia, indicando questi con

il ciclo vitale di un vivente può essere rappresentato da un modello compartimentale (Fig. 1), dove k=1 indica il primo stadio dopo la nascita e k=K indica lo stadio precedente la morte:

Fig. 1: Rappresentazione compartimentale degli stadi del ciclo vitale di un vivente.

Tutti gli individui appartenenti alla specie del vivente considerato passano attraverso la stessa successione di stadi, ma di solito, lo fanno in tempi diversi. Di conseguenza, un insieme di viventi della stessa specie che vivono nello stesso ambiente (popolazione) risulta, in qualsiasi istante, distribuito tra i diversi stadi del ciclo vitale (popolazione strutturata). Indicando con j (j= 0, 1, …, J) l'indice temporale (ad esempio i giorni dell'esperimento) a partire da un istante (giorno) iniziale j=0, lo sviluppo di una popolazione, nei k stadi, è rappresentato dal vettore

dove nj,k indica il numero (la frequenza) di individui presenti nello stadio k-esimo al giorno j fissato. Giorno per giorno, al variare di j, questo vettore assume valori differenti (la popolazione è un sistema dinamico che evolve nel tempo); ordinando i vettori in una matrice si ottiene la distribuzione della popolazione negli stadi, al variare del tempo.

Questa matrice è nota col nome di matrice Stadio-Frequenza (Manly, 1974).
Sommando i termini di una riga si ottiene il numero di individui (vivi) al giorno j-esimo:

esprime la condizione iniziale della popolazione. Esso indica il numero di individui che si trovano nei diversi stadi nel giorno (considerato) iniziale. Nel caso che questo vettore possieda tutte componenti nulle tranne la prima

Nel presente lavoro le popolazioni sono tutte delle coorti; per esse verrà considerato solo una parte del ciclo vitale, un suo sotto-insieme composto da una classe di stadi che ha inizio con k=1 e termina con k=k* (metamorfosi). A questo scopo è stata definita una nuova matrice

che chiameremo matrice stadio-frequenza modificata ottenuta dalla matrice stadio-frequenza (2) in cui, la prima riga è il vettore definito in (5) e l'ultima colonna è composta da termini (mj,k*) che rappresentano il numero di individui che hanno raggiunto o superato lo stadio k*-esimo. Se ci riferiamo ad una coorte m0,k* = 0. Questi nuovi elementi (somma degli individui da k* fino a K di (2)) sono:

dove il secondo termine della (7) rappresenta la somma degli individui morti dal giorno 0 fino al giorno j , e dallo stadio k* fino K.
La rappresentazione dell'ultima colonna della matrice (6) permette di visualizzare come, nel tempo, si riempie lo stadio k* e, ancor più, permette di calcolare il flusso giornaliero di individui in esso entrante:

Avendo definito k* come stadio di maturazione della coorte allora la variazione nel tempo di rj,k* rappresenta la distribuzione dei tempi di maturazione.
Attraverso la matrice (6) è possibile calcolare anche l'indice

che assume valori crescenti (talvolta stazionari) col passare del tempo, cioè all'aumentare di j. Lo sviluppo di una popolazione, infatti, è un fenomeno irreversibile ed i suoi individui, se non muoiono, col trascorrere del tempo, devono raggiungere stadi di sviluppo con k sempre maggiori. Il valore sj, pertanto, può essere considerato come un indice d avanzamento attraverso gli stadi della popolazione. Si può notare che per k=k* la (9) presenta un valore asintotico. A causa della arbitrarietà della definizione degli stadi del ciclo vitale, l'indice di sviluppo sj non può essere considerato una misura dello sviluppo della popolazione. Esso, tuttavia, risulta utile per mettere in evidenza quei casi in cui due campioni della stessa popolazione si sviluppino a diverse velocità.

L'esperimento è stato condotto presso il laboratorio di Bioclimatologia situato al 3° piano del dipartimento di fisica "E. Fermi" dell'università "La Sapienza" di Roma, e presso il terrazzo del medesimo dipartimento. In laboratorio sono stati costruiti appositi acquari ad elevata capacità termica ognuno composto da un acquario in vetro all'interno di un contenitore , più grande, in plastica rivestito di materiale opaco e isolante (rubatex). Nell'intercapedine fra l'acquario in vetro e il contenitore in plastica circolava acqua distillata a temperatura costante creando così le condizioni di bagno termico. Un sensore immerso nell'acqua dell'intercapedine ha permesso di controllare 24 ore al giorno la costanza della temperatura. Le dimensioni di ciascun acquario erano (0.51´0.31´0.35)m per un volume di 0.055m3, ossia 55 litri di acqua in cui sono stati allevate le larve di X. Laevis. Ogni vasca veniva poi coperta da un coperchio in plastica anch'esso rivestito in rubatex.
In Fig. 2 è riportata la vista laterale del sistema.

Un sistema idraulico ha permesso di far circolare nell'intercapedine acqua a temperatura costante. In una vasca di plastica (denominata V) veniva portata l'acqua distillata (circa 80 litri) alla temperatura desiderata per mezzo di un sistema di termoregolazione; questo era composto da un termoregolatore (Eurotherm mod. 91), un cavetto riscaldante (Dupla 60W) e da un sensore di temperatura per misure in acqua (PT100). L'acqua riscaldata alla temperatura di (24.0±0.3)°C, attraverso un tubo in gomma e per mezzo di una pompa, veniva immessa nell'intercapedine forzando così la temperatura dell'acqua all'interno dell'acquario con gli animali. Un tubo di scarico riportava l'acqua alla vasca in plastica V, chiudendo così il circolo del bagno termico. E' stato verificato che, quando viene a mancare l'alimentazione elettrica del termoregolatore, questo tipo di sistema riesce a mantenere per cinque ore la variazione di temperatura dell'acqua nell'acquario in vetro entro il grado centigrado. La visione schematica dell'intero apparato sperimentale è riportata in Fig. 3

Fig. 3: Schema dell'apparato di alimentazione dell'acqua a temperatura costante per il bagno termico di uno dei sistemi di allevamento delle coorti.

A secondo del tempo di esposizione a radiazione solare i tre acquari (contenenti le tre coorti) sono stati indicati con: A150, A600, A0. Il numero a pedice indica i secondi di esposizione, per giorno, a radiazione solare: "150" indica 150 secondi di esposizione, "600" indica 600 secondi di esposizione e "0" indica nessuna esposizione, cioè acquario di controllo.
Per l'esposizione alla radiazione solare si sono usate delle vasche rettangolari in plastica, di colore bianco all'interno e nero al di fuori. Le dimensioni erano (0.5´0.30´0.12)m. Le vasche venivano posizionate ad una distanza di circa tre metri dagli strumenti di misura della radiazione e su apposite staffe al fine di isolare dalla superficie di appoggio. Le misure sono state condotte nella banda spettrale UV-B (280-320nm) anche se i valori ambientali di radiazione atmosferica di lunghezza d'onda inferiore a 294nm sono praticamente nulli (<10-4 Wm-2; dato fornito da G-MET). Una coorte, durante i 70 giorni di esperimento, ha ricevuto mediamente una dose di 334 Jm-2d-1, l'altra una dose media di 1290 Jm-2d-1. Per fare ciò, l'irradianza (Wm-2) misurata dallo strumento (UVBT Scintec Sensors) è stata moltiplicata per il tempo di esposizione (150s e 600s). Si è ottenuta così la dose giornaliera (Jm-2d-1) di radiazione UVB a cui è stata esposta ciascuna coorte.
L'andamento in Fig. 4 si riferisce ai valori ambientali di irradianza misurata durante il periodo di sperimentazione (70 giorni), mediati, giorno per giorno, nell'intervallo orario 12.00-14.00 (fascia oraria nella quale è avvenuta l'esposizione delle coorti).

Fig.4: Valori di irradianza (regione spettrale 280-320nm) agenti giornalmente sulle coorti.

Nell'esperimento abbiamo utilizzato tre coorti provenienti dalla medesima coppia di adulti. Una coorte è stata allevata in laboratorio, in assenza di luce per tutta la durata dell'esperimento, e ha svolto la funzione di coorte di controllo. Le altre due coorti hanno subito il medesimo trattamento a differenza di una esposizione giornaliera, con tempi differenti per le due coorti (150 secondi e 600 secondi), a radiazione solare atmosferica. E' stata prestata la massima attenzione nel garantire che lo sviluppo delle coorti sottoposte ad esperimento, avesse luogo in condizioni uguali, soprattutto per quel che riguarda la qualità e la costanza della temperatura dell'acqua negli acquari e durante l'esposizione a radiazione, la composizione e la somministrazione della dieta, i metodi di osservazione. Come già scritto l'unica eccezione riguarda l'esposizione a radiazione solare per le due coorti.
Tre giorni prima del giorno stabilito come inizio dello sviluppo delle coorti (j=0), un maschio adulto di X. laevis è stato inoculato con ormoni gonadotropi nel sacco dorsale linfatico (profasi HP, serono, 300 unità diluita in 0.5 cc di soluzione fisiologica). Il giorno successivo è stata eseguita la stessa inoculazione nello stesso maschio. Il terzo giorno, infine, lo stesso maschio ha subito per la terza volta lo stesso trattamento, ma questa volta è stata inoculata, con una dose doppia di quella del maschio (600 unità in 10 cc di soluzione fisiologica) anche una femmina adulta di X. laevis. Il trattamento descritto aveva lo scopo di assicurare l'accoppiamento degli adulti inoculati e l'oviposizione nei tempi previsti. Infatti, dopo l'ultima inoculazione, il maschio e la femmina sono stati posti in un acquario alla temperatura di 20 °C, al buio, nel quale ha avuto luogo l'accoppiamento. Il giorno successivo (15-17 ore dopo l'inizio dell'accoppiamento) hanno deposto circa 800-1000 uova fecondate. Questo è stato assunto come il giorno iniziale dello sviluppo delle coorti, il giorno al quale è stato attribuito l'indice j=0 (vedi 2.1 "matrici stadio frequenza").
Attraverso un sistema di monitoraggio e controllo della temperatura si è garantita una temperatura di 24°C dell'acqua in cui sono state deposte le uova (temperatura alla quale si sono poi sviluppate le coorti di X. laevis).
Soltanto il terzo giorno dopo l'oviposizione (j=3), quando i nuovi nati sono passati dallo stadio embrionale a quello larvale, sono stati scelti, in modo casuale, tra di essi 300 individui e sono state formate le tre coorti, ancora una volta scegliendo a caso gli elementi della stessa, da impiegare nell'esperimento. Queste tre coorti sono state trasferite dall'acquario di oviposizione negli acquari A0 e A150 e A600, sterilizzati in precedenza (mediante soluzione di permanganato di potassio), e contenenti acqua a 24 °C.
Il quinto giorno dopo l'oviposizione (j=5), quando nelle larve di X. laevis (girini) era in atto la formazione dell'apparato digerente, ha avuto inizio la somministrazione del cibo. La dieta giornaliera dei girini è consistita in un infuso di ortica, preparata come segue: ogni giorno 13 g di polvere di ortica sterilizzata e virus-esente venivano chiusi in un sacchetto di seta che non ne lasciava passare i granelli e fatti bollire per 40 minuti in un becker. Dopo un'accurata ed energica strizzatura nell'acqua di bollitura, il sacchetto veniva posto in un forno a 110 °C per la determinazione del residuo secco. Diluendo l'acqua di bollitura, contenente in media 10 g di ortica, in 600 cc di acqua di rubinetto, è stato preparato l'infuso di ortica somministrato ai girini nella misura di 300cc per acquario.
La somministrazione di cibo ha reso necessaria la pulizia periodica degli acquari. Le particelle d'ortica non consumate, i rifiuti organici dei girini, nonché gli eventuali girini morti, accumulati sul fondo degli acquari, avrebbero potuto pregiudicare la qualità dell'acqua. Allo scopo di evitare questo pericolo e garantire ai girini una ossigenazione adatta la pulizia degli acquari è stata effettuata a giorni alterni, insieme al ricambio completo dell'acqua.
Il sesto giorno dall'oviposizione (j=6) è iniziata l'esposizione a radiazione solare atmosferica per due delle tre coorti. Tutte le larve sono state pescate e contate (100 elementi ognuna coorte), due coorti sono state poste in vasche in plastica bianca contenenti 15 litri di acqua e posizionate in terrazzo (sopra opportuni spessori per isolare dalla superficie dello stesso) ed esposte alla radiazione. Al termine dell'esposizione è stata controllata la temperatura dell'acqua contenente le due coorti (al fine di garantire la costanza della temperatura entro 0.3°C) per poi essere riposizionate negli acquari in laboratorio.
Dall'undicesimo giorno successivo all'oviposizione (j=11) i girini hanno raggiunto un grado di robustezza tale da poter essere posti senza danni sotto un microscopio, ma le osservazioni sistematiche (giornaliere) hanno avuto inizio il giorno ventesimo (j=20). Questo è accaduto quando i girini nei tre acquari avevano raggiunto mediamente lo stadio 50 della classificazione di riferimento di Nieuwkoop and Faber (1956).
Dopo essere stati pescati dal proprio acquario, i girini sono stati posti, uno per uno, in una capsula Petri, sono stati osservati, uno per uno, al microscopio binoculare stereoscopico (Leica, modello MS 5, ingrandimento massimo 40´) ed attribuiti, uno per uno, ad uno degli stadi della classificazione di Nieuwkoop and Faber. Nel nostro esperimento sono stati presi in considerazione gli stadi che, secondo la classificazione, vanno dal 48 al 58, cioè dal termine della formazione dell'intestino all'inizio della metamorfosi. In tali stadi, il carattere che meglio evidenzia il processo di sviluppo e che consente di individuare con maggiore facilità lo stadio raggiunto è la morfologia degli arti posteriori e anteriori.

Le osservazioni giornaliere dei girini delle coorti e la loro attribuzione ad uno degli stadi di sviluppo hanno permesso di costruire le matrici stadio-frequenza modificate definite in (6) di 2.1.

Fig. 6: Numero di individui sopravvissuti in funzione del tempo, nelle tre coorti dell'esperimento. Per le tre coorti è indicato, in legenda, il tempo di esposizione a radiazione UV atmosferica.

La Fig. 6 mostra l'andamento della numerosità di ciascuna coorte in funzione del tempo: in ordinate è stato riportato, con cadenza giornaliera, il numero di individui vivi per ciascuna coorte. Si possono notare tre eventi: il primo riguarda l'inizio della diminuzione della numerosità. Per tutte avviene il sesto giorno (j=6 inizio esposizione a radiazione). La diminuzione della numerosità è nettamente maggiore per la coorte esposta a 600s rispetto a quella esposta a 150s e al controllo. Ciò rispecchia la capacità della coorte (piuttosto che il singolo) di evidenziare sensibilità di risposta alla perturbazione. Il secondo evento riguarda la stabilizzazione del numero di vivi man mano che il tempo avanza; ciò testimonia che i girini, progressivamente nel tempo, avvertono in maniera differente (non letale) l'azione di stress da radiazione. Il terzo evento riguarda la differenza sostanziale della numerosità, a fine esperimento, della coorte esposta a 600s rispetto quella di controllo e quella a 150s: al termine dell'esperimento le cifre indicano nel controllo A0 un totale di 95 vivi, 94 vivi in A150, 81 in A600. In quest'ultimo la dose più elevata di radiazione UV ha determinato la morte di un numero maggiore di individui. Osservazioni al microscopio hanno rivelato che tutti i 19 individui morti si trovavano in stadi molto precoci dello sviluppo rispetto il resto della coorte. Ciò potrebbe far pensare ad un'azione più efficace della radiazione UV per gli individui che si trovano nei primissimi stadi larvali. Oltretutto la morte degli individui meno avanzati nella fase di sviluppo ha inevitabilmente mascherato gli effetti sub-letali che, al contrario, si sono rivelati nella coorte A150 (vedi Fig. 7 e Fig. 8).

Fig. 7a,b: In fig. 7a è riportato l'indice di avanzamento attraverso gli stadi larvali della coorte A0 (cerchi vuoti) e A150 (cerchi pieni). In fig. 7b è riportato l'indice di avanzamento attraverso gli stadi larvali della coorte A0 (cerchi vuoti) e A600 (quadrati pieni). In legenda è indicato il tempo di esposizione a radiazione UV atmosferica.

In Fig. 7a,b è riportato l'algoritmo (9) definito in 2.1 che rappresenta l'indice di avanzamento delle coorti attraverso gli stadi, in funzione del tempo. Tale indice ha senso quando viene eseguito su coorti con percentuali di mortalità £10%. Inoltre ha senso quando la numerosità delle coorti risulti confrontabile (il numero totale di individui non deve differire oltre le 2-3 unità percentuali tra una coorte e l'altra). Da Fig. 6 si nota che la coorte in A600 (in cui la mortalità risulta del 19%) è sensibilmente meno numerosa rispetto le coorti A0 e A150. Per le condizioni fatte l'indice di avanzamento di A600, seppur riportato in fig. 7b, è da considerare non rappresentativo del reale andamento della coorte stessa e non confrontabile con A0.
In fig. 7a gli effetti sub-letali della radiazione sono visibili: si può notare come la coorte esposta a radiazione (A150) proceda con leggero vantaggio fino al 25° giorno di sviluppo (1 stadio circa di vantaggio rispetto A0), per poi rallentare progressivamente fino ad intersecare A0 il giorno 35. In questo punto le pendenze delle due curve risultano differenti: A0 continua ad avere la stessa pendenza che aveva in precedenza, costante fino a quando alcuni individui della coorte incominciano ad occupare lo stadio di maturazione (k*=58) per il quale la (9) presenta un valore asintotico; al contrario A150 presenta una pendenza inferiore rispetto A0 (tendenza già riscontrata tra il 25° e il 35° giorno) tale da evidenziare un consistente rallentamento dello sviluppo attraverso gli stadi. Per quantificare in giorni tale rallentamento basta calcolare il lasso di tempo impiegato dalle due coorti per passare dal valore sj = 55 (stadio 55 raggiunto per tutte e due il giorno 35°) al valore sj " 56 (stadio 56): A0 raggiunge tale valore il giorno 42, mentre A150 lo assume il giorno 65, con ben 23 giorni di ritardo. Il rallentamento di sviluppo della coorte esposta comporta inoltre che al termine del tempo standard di sperimentazione (70 giorni), in A0 il numero di individui che deve arrivare a maturazione rappresenta il 9% del totale, mentre in A150 oltre il 59% del totale deve ancora raggiungere tale stadio.
Interpretiamo questo comportamento come l'azione della radiazione ultravioletta atmosferica su A150; Azione che non determina effetti letali ma che, a piccole dosi ogni giorno, produce effetti sub-letali (rallentamento di attraversamento dello stadio larvale) tali da essere misurati solo su un campione sufficientemente numeroso di individui (coorte di 100 individui) e, per lo X. laevis, dopo 70 giorni si misure sperimentali.

Fig. 8a,b: Istogramma della Distribuzione dei tempi di maturazione della coorte A0 (barre in nero) e A150 (barre in grigio) in fig. 8a, e della coorte A0 e A600 in fig. 8b. In legenda è indicato il tempo di esposizione a radiazione UV atmosferica.

In Fig. 8a,b è riportata la distribuzione dei tempi di maturazione in funzione del tempo, calcolata mediante l'algoritmo (8) di 2.1 applicato all'ultima colonna delle matrici S-F riportate in appendice. La distribuzione è rappresentata sottoforma di istogramma, in cui ogni colonna rappresenta il numero di individui (frequenza) che giornalmente passano allo stadio di maturazione (k*=58).
Anche in questo contesto la distribuzione di A600 confrontata con A0, riportate in fig. 8a, è da intendere come non rappresentativa della situazione reale dell'intera coorte (81 elementi di A600 sono non confrontabili con 95 di A0).
Per le altre due distribuzioni è stato calcolato il tempo medio di maturazione e la relativa deviazione standard. E' stata fatta l'ipotesi che ed è stata calcolata la probabilità che questa si verifichi (p calcolata mediante t-test).
I risultati sono riportati in Tab. 8

	<t>	s	p
A₀	55.1	4.5	<0.08
A₁₅₀	73.6	6.8	<0.08

Tab. 8: Tempi medi, deviazione standard e analisi del t-test della distribuzione dei tempi di maturazione delle coorti.

Dalla tabella si può notare la notevole differenza (p < 0.08) che intercorre tra il tempo medio di raggiungimento dello stadio di maturazione di A0 rispetto A150. Mediamente la coorte di individui esposti a radiazione UV atmosferica, nati nello stesso istante della coorte di individui non esposti A0, raggiunge la maturazione con circa 18 giorni di ritardo nei confronti degli individui non irradiati.

I risultati del presente lavoro mostrano gli effetti della radiazione ultravioletta atmosferica sulla dinamica di sviluppo di coorti di Xenopus laevis nello stadio larvale. Gli effetti della radiazione solare a lunghezze d'onda maggiori della radiazione UV non sono da escludere: studi recenti vertono proprio sull'effetto di radiazione visibile sull'epidermide umana. Queste ricerche sono però ancora in una fase embrionale, e in numero molto minore rispetto i lavori riguardo gli effetti della radiazione UV-B sugli esseri viventi. E' noto, infatti, che tale radiazione, anche a basse intensità, trasporta una energia tale da interagire direttamente con il DNA. In base alle ricerche di oltre mezzo secolo, e nell'attesa di nuove scoperte, la nostra opinione non può che essere che gli effetti osservati sulle coorti sono stati generati dalla radiazione UV-B atmosferica.
Sono state utilizzate tre coorti, due esposte a radiazione e una di controllo (non esposta a radiazione). Gli effetti sono stati differenti al variare della dose di radiazione che ha agito sulla coorte. Due diverse dosi sono state utilizzate nell'esperimento nei confronti delle due coorti: quando una delle due coorti esposte (A600) è stata soggetta ad una dose 4 volte maggiore dell'altra (A150), la radiazione UV ha agito direttamente sulla vitalità degli individui, creando un'elevata percentuale di mortalità (19% in A600). L'analisi dei dati di mortalità ha evidenziato che l'effetto letale della radiazione si è riscontrato maggiormente negli stadi precoci di sviluppo (individui più vulnerabili allo stress): il tasso di mortalità percentuale, dopo la forte variazione del 6°giorno, si è infatti progressivamente stabilizzato con il trascorrere del tempo. In termini di sopravvivenza è il tempo di esposizione a radiazione il fattore determinante: quando la dose supera un determinato valore di soglia i danni subiti dall'organismo non sono più riparabili, situazione che porta inevitabilmente alla morte dello stesso.
Quando la dose è tale da non creare mortalità gli effetti sulla coorte sono di entità differente e rivelabili con maggior dettaglio attraverso l'analisi della dinamica di sviluppo. Mediante l'indice di avanzamento si nota come la coorte esposta rallenti progressivamente la velocità di passaggio attraverso gli stadi dello sviluppo larvale; per avanzare di uno stadio (stadio 55 ® stadio 56) tale coorte impiega fino a 23 giorni in più rispetto alla coorte non irradiata.
Di conseguenza tale andamento si riflette sui tempi di maturazione delle coorti. Dall'analisi delle distribuzioni dei tempi di maturazione si ha che mediamente la coorte esposta a radiazione UV matura con circa 18 giorni di ritardo rispetto la coorte non esposta. Quest'ulteriore risultato ribadisce l'effetto a scala macroscopica dell'azione sub-letale della radiazione UV atmosferica sugli individui della coorte.
I risultati ottenuti, interpretati mediante l'indice di avanzamento e la distribuzione dei tempi di maturazione, evidenziano come un insieme di individui nati nello stesso istante (coorte) è in grado di rivelare con maggior dettaglio l'effetto di uno stress di debole intensità (stress blando) su di essi agente.

Si ringrazia la dott. Annamaria Siani e il dott. Giuseppe Casale, del gruppo G-MET, per la consulenza fornita riguardo le misure di UV-B e per la calibrazione degli strumenti di misura.
Si ringrazia il Sig. Carmelo Romano per l'assistenza tecnica, i consigli pratici e la pazienza nell'eseguire i lavori per la realizzazione dell'apparato sperimentale.

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